Im Spiel selbst treten zwei Mannschaften, Legion (Die Guten) und Hellbourne (Die Bösen), mit jeweils bis zu fünf Spielern gegeneinander an. Jeder Spieler steuert genau einen von 60 vorhandenen Helden. Beide Mannschaften besitzen eine Basis, wobei die Basen durch drei Hauptpfade (Lanes) quer über die gesamte Karte miteinander verbunden sind. Jede Basis und die Pfade sind dabei mit stationären Verteidigungsgebäuden (Türme) gesichert. Die Basis bietet den Spielern zusätzlich Läden, in denen Gegenstände (Items) für Gold gekauft werden können, die den Kampfwert ihrer Helden erhöhen, sowie einen Regenerationsbrunnen. Einige Läden sind jedoch auch außerhalb der Basen zu finden. Die Spieler der Legion starten dabei im südwestlichen Gebiet der Karte, die Spieler der Hellbourne im nordöstlichen.

Ziel des Spiels ist es, das Hauptgebäude (Worldtree) in der gegnerischen Basis zu zerstören. Um den Spieler dabei zu unterstützen werden in beiden Basen in periodischen Abständen computergesteuerte Einheiten (Creeps) erzeugt, die entlang der Haupfpfade zur gegnerischen Basis laufen, um diese anzugreifen.

Die Spieler erhalten durch das Töten von gegnerischen oder neutralen Einheiten Gold. Außerdem gewinnen die Helden Erfahrungspunkte, indem sie sich in der Nähe von sterbenden gegnerischen oder neutralen Einheiten befinden. Die vom Helden gesammelten Erfahrungspunkte führen dazu, dass eine höhere Stufe erreicht wird, die den Helden stärker macht und das Erlernen neuer Fähigkeiten ermöglicht. Der Held kann von Level 1 bis zum Maximal-Level 25 aufsteigen und eine Vielzahl von speziellen Fähigkeiten erlernen.

Neutrale Einheiten sind in den Wäldern an festen Plätzen zu finden. Auch diese Creeps werden in periodischen Abständen an festen Positionen (Creepspot) erzeugt, wenn zu dem bestimmten Zeitpunkt keine Einheiten mehr an dieser Stelle sind, die Creeps also getötet oder weggelockt wurden. Unter den neutralen Creeps befindet sich eine besonders starke neutrale Einheit: Kongor. Wird Kongor getötet, verliert er das Item 'Token of Life', welches man nur bei dieser Gelegenheit erhalten kann. Ab dem dritten Tod Kongors wird von ihm zusätzlich die sogenannte Banane fallen gelassen, welches einmalig bis zu 2000 Lebens- und 1500 Manapunkte heilt. Roshan erscheint alle 10 Minuten; sollte das Token bis dahin noch nicht verbraucht worden sein, wird es zerstört. Mit dem Fortschreiten der Spielzeit nimmt er an Stärke zu, um sich so den Spielerhelden anzupassen.

Da jedes Team versucht die eigene Basis mit allen Kräften zu verteidigen, kommt es oft zu größeren Gefechten zwischen den Helden. In solchen großen Gefechten (Clashes) gewinnt meistens das Team, das dem anderen durch Spielerfahrung, Geschick, Level (und Items) des Helden und/oder Kombination der eingesetzten Fähigkeiten überlegen ist. Das Besiegen feindlicher Helden gibt besonders viel Gold und Erfahrungspunkte. Sobald ein Held mehrere Kills schnell in Folge erreicht, bekommt er Auszeichnungen, wie beispielsweise Double Kill, , Ultra Kill oder Rampage . Für den ersten Kill, oder für viele Kills in Folge, ohne selbst zu sterben, werden Auszeichnungen, wie First Blood und Killing Spree bis zu Beyond Godlike vergeben. Allerdings sind all diese Auszeichnungen für den betroffenen Spieler gänzlich ohne praktischen Nutzen.

Eine beliebte Spieltaktik in DotA ist das sogenannte Gangen. Dabei versuchen mehrere Helden eines Teams eine möglichst weit vorgedrungene kleinere Gruppe gegnerischer Helden (oder einen Einzelnen) zu überraschen und präzise zu töten ohne dabei selbst in Gefahr zu geraten. Taktiken für einen erfolgreichen Gang sind Einkreisen, Verlangsamen oder/und handlungsunfähig machen (auch Disablen oder Stunnen genannt) des Gegners.